化學(xué)發(fā)光基礎(chǔ)知識

一、什么是化學(xué)發(fā)光，與放免、酶免比較有何不同？

化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相 結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析比放射免疫，酶聯(lián)免疫具有更高靈敏度，具備操作簡便、快速的特點(diǎn)， 易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保存期長，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床 實(shí)驗(yàn)診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

(1) 與放免（RIA)產(chǎn)品比較

與放射免疫試劑（RIA)比較，化學(xué)發(fā)光避免了放射性核素的污染以及對操作人員的傷害， 大大縮短了反應(yīng)時間，同時兼具高靈敏度的優(yōu)勢。

(2) 與酶免（ELISA)產(chǎn)品比較

靈敏度與可測范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶免產(chǎn)品，兼具ELISA法簡便的操作方法與較短的反應(yīng)時間。

二、什么是標(biāo)記免疫技術(shù)，它的三大要素是什么？

將Ag或Ab用標(biāo)記物(如熒光素、酶、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等)進(jìn)行標(biāo)記，在與標(biāo)本 中的相應(yīng)Ab或Ag反應(yīng)后，可以不必測定Ag-Ab復(fù)合物本身，而測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過標(biāo) 記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。

三要素：通常在檢測系統(tǒng)中會使用到一種叫標(biāo)記物（labeling)的物質(zhì)，常標(biāo)記在抗體上 通常會有一個分離（separation)的過程在最后讀取信號前 需要去仔細(xì)關(guān)注一下分析的模式（format)

三、標(biāo)記免疫技術(shù)主要有哪幾種？

主要經(jīng)歷了四種標(biāo)記免疫技術(shù)的發(fā)展：

熒光素(Fluorophores) - FIA

放射性同位素(Radioisotopes) - RIA

酶（Enzymes) - EIA

化學(xué)發(fā)光物質(zhì)-CLIA

四、化學(xué)發(fā)光原理？ 分析方法及過程

釆用微孔板作為固相載體，以魯米諾作為發(fā)光劑，固相載體的應(yīng)用擴(kuò)大了測定的范圍。以競爭法、夾心法等免疫測定方法為基礎(chǔ)。每個試劑盒都包含標(biāo)準(zhǔn)品、酶結(jié)合物、底物、洗液、包被板，降低了試劑成本，減少了交叉污染，保證了檢測質(zhì)量。

⑴、抗原抗體結(jié)合：將待測標(biāo)本加入包被單克隆抗體的微孔板中，標(biāo)本中的抗原與微孔板的抗體結(jié)合，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體，經(jīng)溫育后形成固相包被抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。

⑵、洗滌、分離：經(jīng)過5次洗滌，很快將未結(jié)合的多余抗原和酶標(biāo)記抗體洗去。

⑶、加入底物luminol發(fā)光劑：luminol被結(jié)合在微孔板的辣根過氧化物酶的催化下可以催化經(jīng)過過氧化氫的分解，使過氧化氫變成水和單氧，其中單氧可氧化魯米諾，魯米諾經(jīng)氧化后可發(fā)出藍(lán)光。這種化學(xué)發(fā)光持續(xù)時間長，可達(dá)數(shù)小時之久。通過光量子閱讀系統(tǒng)記錄發(fā)光強(qiáng)度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的濃度。

五、什么是鉤狀效應(yīng)（hook effect)，如何判斷及解決？

免疫測定的實(shí)質(zhì)是抗原抗體反應(yīng)，抗原抗體反應(yīng)是按?定的分子比例結(jié)合，當(dāng)二者比例適中 時，形成的免疫反應(yīng)最強(qiáng)烈，形成復(fù)合物或檢測的信號與所測的抗原或抗體成比例關(guān)系，但當(dāng)抗 原或抗體其中一者過量時，免疫反應(yīng)將減弱，測定值呈現(xiàn)假性低值。

在化學(xué)發(fā)光中像二步分析法…般都能避免鉤狀效應(yīng)，對于一步夾心法項(xiàng)目說明書中都提到了 產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)的上限如人絨毛膜促性腺激素的鉤狀效應(yīng)值是100萬在實(shí)際工作中如遇到 測定值與臨床嚴(yán)重不符的結(jié)果要考慮到鉤狀效應(yīng)，解決辦法是稀釋此樣本。

六、什么是嗜異性抗體？

病人樣品中可能自然產(chǎn)生一些針對動物免疫球蛋白的抗體(通常是鼠或羊)，-般來源于暴露于這些動物或接受過動物血清的治療，分析的干擾：可以在雙單克隆夾心法分析模式中引起假陽性，可以在單克隆/多克隆分析模式中出現(xiàn)假陰性。

廠家在試劑生產(chǎn)中會加入封閉劑，封閉劑可以加在反應(yīng)基質(zhì)中或整合在試劑盒內(nèi)：鼠（鼠科 類)，鳥（鳥科類）和羊蛋白，各個廠家生產(chǎn)的分析試劑都有可能會不同程度的受到任何一個病人血清的影響！當(dāng)遇到與臨床不符的結(jié)果時要詢問病史看是否有嗜異性抗體的干擾。

七、什么是基質(zhì)效應(yīng)？

基質(zhì)是指的是樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前最常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是，通過已知分 析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，同時盡可能保持樣品中基質(zhì)不變，建立一個校正曲線（calibration curve)。

八、稀釋樣品時稀釋物不對為何有基質(zhì)效應(yīng)？

我們在稀釋樣品時要考慮到基質(zhì)效應(yīng)的影響，稀釋必須在適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中進(jìn)行，對于 大多數(shù)測定而言，適當(dāng)?shù)幕|(zhì)就是零校準(zhǔn)品，如果分析物稀釋基質(zhì)效應(yīng)中所含成分濃度不正 確，稀釋回收率就不能對它們進(jìn)行準(zhǔn)確的測定，因?yàn)樗鼈兿♂尯髸cBing agent形成新的平衡。

九、如何看待說明書中的方法局限性？

此章節(jié)的內(nèi)容極為重要，實(shí)驗(yàn)室工作人員必須對其進(jìn)行理解，因?yàn)樗P(guān)系到實(shí)驗(yàn)室能否對 樣本分析結(jié)果進(jìn)行正確的解釋。在解釋結(jié)果時，需參照該病人的整體臨床情況，包括：癥狀、 臨床病史以及其它測試所得的數(shù)據(jù)和其它相應(yīng)的信息。

十、如何理解最高可報告值？

當(dāng)樣品濃度高時，可以報告大于最高校準(zhǔn)品值的結(jié)果，有些試劑生產(chǎn)商的的測定系統(tǒng)通常 用亮點(diǎn)調(diào)整來代替完全校準(zhǔn)，這樣的話他們可報告范圍是一個擬合而出的最高水平（而非 實(shí)際測定值)。而在ACCESS檢測系統(tǒng)中，用戶自己創(chuàng)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)該標(biāo)準(zhǔn)曲線意境通 過并且質(zhì)控檢測被接受時，就可以證實(shí)其可報告的上限。當(dāng)樣本分析所得的RLU值高于最 高校準(zhǔn)品時，以樣本結(jié)果大于最高校準(zhǔn)品值的形式報告，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對大多數(shù)測定項(xiàng)目的 分析結(jié)果使用這種直接報告模式，如果需要獲得確切的測定值，則需要進(jìn)行機(jī)外人工稀釋 并重新分析樣本。

十一、如何理解最低可報告值？

所有的定景測定在曲線的下端通常都有一個零標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)允許計算結(jié)果低至零，當(dāng)測定 結(jié)果越接近零時，測定結(jié)果就越不那么精確。在說明書中給出了項(xiàng)目的檢測最低下限，建 議以低于該下限來報告結(jié)果。

十二、什么是分析靈敏度？

分析零敏度通常是對標(biāo)準(zhǔn)曲線上的零點(diǎn)校準(zhǔn)品距零值的2SD值范圍來進(jìn)行測定計算的（而 SD值是將零校準(zhǔn)品作為未知濃度樣品經(jīng)多管檢測后計算均值所得）

十三、什么是功能靈敏度？

功能靈敏度(Functional sensitivity)為<20%CV時所能檢測到的最低極限濃度，它反映在實(shí)際樣品檢測時所能達(dá)到精確定量的檢測極限。

十四、如何理解說明書中的稀釋回收率？

稀釋回收率與稀釋線性不不完全是一回事，但是二者可用同一個研究方式來檢驗(yàn)，要進(jìn)行 稀釋回收率測定首先用戶需要選取…個已知濃度的病人樣本，在分析項(xiàng)目的線性范圍內(nèi)對 其進(jìn)行多點(diǎn)稀釋后進(jìn)行檢測，如果所測得結(jié)果與最初的樣本稀釋系數(shù)結(jié)果相匹配，那么就 驗(yàn)證了稀釋回收率與檢測線性范圍。稀釋線性與回收率的區(qū)別在于，將一組分析物校準(zhǔn)品 當(dāng)未知樣品進(jìn)行分析，來對其檢測線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證。

十五、定標(biāo)液為凍干粉的些注意事項(xiàng)？

如 T3、T4、FT3、FT4、TSH等

凍干粉定標(biāo)液復(fù)溶：復(fù)溶水的水質(zhì)加樣容器的準(zhǔn)確度加樣的技術(shù)混勻/旋轉(zhuǎn)

復(fù)溶后定標(biāo)液保存：使用合適的冷凍保存試管正確標(biāo)簽無霜冰箱保存

十六、化學(xué)發(fā)光項(xiàng)目是否可以使用血漿等其他樣本類型，有無影響？

并不是所有的免疫項(xiàng)目都可以使用血漿，具體請參閱項(xiàng)目說明書，但為了避免不同項(xiàng)目樣本類型的差異，同時保證同一患者使用同樣的樣本類型，因此我們推薦統(tǒng)一使用血清樣本。

十七、樣本溶血、脂血對化學(xué)發(fā)光結(jié)果項(xiàng)目有影響嗎？

樣本溶血、脂血、黃疸對化學(xué)發(fā)光項(xiàng)目同樣是有影響的，不過影響機(jī)制與影響比色等 項(xiàng)S不同。如溶血對胰島素影響是因?yàn)闃颖救苎蠹t細(xì)胞釋放種胰島素滅活酶而使樣 本中胰島素濃度減少。不同項(xiàng)目對樣本禁忌要求不同，具體請査閱“化學(xué)發(fā)光項(xiàng)目速査 樣本禁忌內(nèi)容”。

十八、樣本分析前處理都應(yīng)該注意什么？

有以下幾點(diǎn)需特別注意：

一、采血管質(zhì)量，有無失效，添加劑是否適當(dāng)，釆血員專業(yè)水平

二、釆血量是否適當(dāng)，是否及時進(jìn)行混勻，血漿應(yīng)該8-10次，血清應(yīng)該5次。

三、血清凝固時間是否充足，離心是否徹底，離心機(jī)是否定期校正。

四、貯存條件是否適當(dāng)。

十九、什么是分析靈敏度和功能靈敏度？

最低檢測濃度/極限(Minimal detectable concentration/limit, MDC/MDL)是反映最低可 區(qū)別于

零值的濃度，又稱分析靈敏度(Analytical sensitivity)。功能靈敏度(Functional sensitivity)

為<20%CV時所能檢測到的最低極限濃度，它反映在實(shí)際樣品檢測時所能達(dá)到 精確定暈的檢測極限。

二十、切點(diǎn)(Cut-off)的概念是什么？

最理想的切點(diǎn)是能將二個不同人群完全分開，例如疾病人群和正常人群。而實(shí)際狀況是人群之間會有一個交叉，所以切點(diǎn)就只能在臨床靈敏度和特異性之間尋找一個相對的平衡點(diǎn)，也就是說需符合臨床的大多數(shù)的需求。